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共聚焦顯微鏡

更新時(shí)間:2021-09-23點(diǎn)擊次數(shù):1404

共聚焦顯微鏡(CLSM)具有成像分辨率高、Z軸深度分辨率高這兩個(gè)特點(diǎn)[1]。這意味著使用共聚焦顯微鏡可以對(duì)某一區(qū)域的生物組織樣本進(jìn)行圖像顯示,并通過(guò)不斷調(diào)節(jié)Z軸深度,對(duì)一定Z軸深度范圍內(nèi)的生物組織進(jìn)行成像,并通過(guò)疊加各個(gè)深度的二位成像,得到該區(qū)域生物組織的三維圖像重構(gòu)圖。是經(jīng)過(guò)了很多年的發(fā)展才實(shí)現(xiàn)了完成顯微鏡所需的激光束掃描。經(jīng)過(guò)不斷地發(fā)展,最終實(shí)現(xiàn)了使用聚焦激光束對(duì)樣品進(jìn)行點(diǎn)對(duì)點(diǎn)掃描,完成二維圖像重構(gòu),再到后期的三維成像。

傳統(tǒng)顯微鏡進(jìn)行成像時(shí)深度分辨率較差,而使用共聚焦顯微鏡可以對(duì)樣品某一層進(jìn)行成像,具有較高的深度分辨率,進(jìn)而可以對(duì)樣本進(jìn)行三維成像。

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工作原理1:

使用激光器發(fā)射出一束激光作為光源,輸出的激光通過(guò)一個(gè)物鏡聚焦在樣品表面。通過(guò)改變激光束聚焦在樣品的位置,實(shí)現(xiàn)激光聚焦點(diǎn)在樣品一片區(qū)域內(nèi)的掃描。產(chǎn)生的熒光信號(hào)經(jīng)過(guò)一個(gè)小孔后,被光電探測(cè)器收集,小孔與焦平面處樣本成共軛關(guān)系,離焦熒光信號(hào)被濾除,使得共聚焦顯微鏡具有一定層析能力。采集激光束掃描至每一點(diǎn)時(shí)激勵(lì)光與樣本反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號(hào),經(jīng)過(guò)圖像重構(gòu)得到該片樣本區(qū)域的熒光成像。

工作原理2:

經(jīng)過(guò)光強(qiáng)調(diào)節(jié)后的激勵(lì)光進(jìn)入一個(gè)由兩個(gè)可快速精密調(diào)節(jié)角度反射鏡組成的XY反射鏡組。兩個(gè)反射鏡分別對(duì)應(yīng)X軸Y軸方向,通過(guò)調(diào)節(jié)兩個(gè)反射角度,使得經(jīng)過(guò)XY反射鏡組的出射激勵(lì)光在一定面積的平面范圍內(nèi)按一定軌跡進(jìn)行掃描。常見(jiàn)的掃描軌跡有柵格形(Raster)掃描軌跡、螺旋形(Spiral)掃描軌跡。

掃描過(guò)程中的入射激勵(lì)光會(huì)與生物組織樣本中的熒光物質(zhì)相互作用產(chǎn)生熒光,一部分熒光會(huì)沿與入射激勵(lì)光相反的方向在先后通過(guò)物鏡和XY反射鏡組后進(jìn)入二向色鏡(Beam Splitter)中,分光鏡會(huì)反射激勵(lì)光,同時(shí)不會(huì)反射信號(hào)光,起到分離激勵(lì)光與熒光的作用。


經(jīng)過(guò)分光鏡后的熒光進(jìn)入到物鏡中再次被匯聚成為焦點(diǎn),并在這個(gè)熒光焦點(diǎn)處加入針孔(Pinhole),此熒光焦點(diǎn)與樣本處焦點(diǎn)具有對(duì)應(yīng)關(guān)系,樣本焦平面以外產(chǎn)生的熒光信號(hào)在經(jīng)過(guò)針孔時(shí)會(huì)被遮擋住,因此僅有樣本焦平面產(chǎn)生的熒光信號(hào)會(huì)通過(guò)針孔,針孔起到濾波作用,使得共聚焦顯微鏡具有深度辨析能力。


經(jīng)過(guò)針孔后的熒光信號(hào)具有較強(qiáng)的層析能力,同時(shí)由于光強(qiáng)較弱,需要使用靈敏度較高的光電探測(cè)器進(jìn)行探測(cè)。在此一般使用光電倍增管(Photomultiplier Tube,PMT)將熒光信號(hào)放大并轉(zhuǎn)換為電信號(hào),此電信號(hào)為模擬信號(hào)。光電倍增管可以在不引入噪聲的情況下將微弱的光信號(hào)放大約一百萬(wàn)倍。光電探測(cè)器輸出的電信號(hào)強(qiáng)度與輸入熒光強(qiáng)度成正比。經(jīng)光電倍增管轉(zhuǎn)換成,與熒光強(qiáng)度成正比的電信號(hào)隨后由模數(shù)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào),此數(shù)字信號(hào)對(duì)應(yīng)樣本焦點(diǎn)處熒光信號(hào)強(qiáng)度。隨XY反射鏡組掃描,通過(guò)探測(cè)特定深度樣本區(qū)域內(nèi)的熒光信號(hào),得到每一點(diǎn)熒光強(qiáng)度對(duì)應(yīng)的數(shù)字信號(hào)值,經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)圖像處理將每一個(gè)數(shù)字信號(hào)值轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的灰度值,每一灰度信號(hào)值對(duì)應(yīng)一個(gè)像素點(diǎn),將每個(gè)灰度信號(hào)與激勵(lì)光掃描軌跡相對(duì)應(yīng)得到成像圖。

共聚焦顯微鏡特點(diǎn)

共聚焦激光掃描顯微鏡通過(guò)引入小孔,使得顯微鏡具有深度分辨率,成像質(zhì)量增加。并且通過(guò)對(duì)體樣本進(jìn)行斷層步進(jìn)成像,通過(guò)后期圖像處理可以得到體樣本三維立體成像。


因?yàn)楣簿劢癸@微鏡為點(diǎn)掃描成像,所以其成像速度相對(duì)較慢。

共聚焦顯微鏡應(yīng)用

為使用共聚焦顯微鏡對(duì)葵花花粉進(jìn)行5微米步進(jìn)斷層成像示意圖,激勵(lì)光為488nm(綠)和543nm(紅)雙波長(zhǎng)配合激勵(lì),所得成像分辨率為3微米。通過(guò)將圖 4中每一層的成像按順序重組,可以得到如圖 5所示的葵花花粉三維成像圖。


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